2024年6月18日，中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院唐士兵研究員與浙江大學楊兵研究員、北京航空航天大學劉超副教授團隊合作，報道了一種新型氟磺酸類可富集化學交聯(lián)的非天然氨基酸并在活細胞中研究蛋白質(zhì)相互作用。相關(guān)成果以“Characterize direct protein interactions with enrichable, cleavable and latent bioreactive unnatural amino acids”為題發(fā)表在學術(shù)期刊Nature Communications。

蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用鑒定是蛋白質(zhì)功能研究的重要步驟，在活細胞中原位鑒定相互作用蛋白對于生物醫(yī)藥研究具有重要意義?；卩徑|發(fā)反應(yīng)（proximity-enabled reactivity）的化學交聯(lián)非天然氨基酸可以捕獲弱作用力和瞬時蛋白質(zhì)相互作用，已被開發(fā)用于原位鑒定活細胞中的蛋白質(zhì)相互作用?；谫|(zhì)譜的交聯(lián)肽段解析能夠提高互作蛋白鑒定的特異性、確定蛋白相互作用界面。然而，由于蛋白質(zhì)樣品和質(zhì)譜數(shù)據(jù)解析過程的復(fù)雜性，對蛋白質(zhì)化學交聯(lián)后的交聯(lián)產(chǎn)物進行高通量鑒定具有挑戰(zhàn)性。在蛋白質(zhì)樣品進行質(zhì)譜分析前，對交聯(lián)肽段進行富集是提高鑒定效率的有效策略。

在本研究中，研究人員開發(fā)了一種基于化學基團氟磺酸的化學交聯(lián)非天然氨基酸，即可富集的氟磺酸-L-酪氨酸（enrichable fluorosulfate-L-tyrosine, eFSY）。利用密碼子擴展技術(shù)可以在蛋白質(zhì)中特定位置插入具有潛在生物反應(yīng)性的非天然氨基酸eFSY，eFSY中氟磺酸通過基于鄰近觸發(fā)反應(yīng)誘導(dǎo)的硫-氟交換 (SuFEx) 點擊反應(yīng)與相互作用蛋白中的酪氨酸、組氨酸或賴氨酸發(fā)生共價交聯(lián)。eFSY攜帶的炔基基團可以通過銅催化疊氮化物-炔環(huán)加成(CuAAC)點擊化學反應(yīng)鏈接生物素，隨后就能實現(xiàn)交聯(lián)肽段的富集，從而提升鑒定交聯(lián)肽段的效率。此外，該研究發(fā)現(xiàn)氟磺酸基團介導(dǎo)的交聯(lián)產(chǎn)物在質(zhì)譜中的混合性碎裂規(guī)律，其與組氨酸及賴氨酸交聯(lián)產(chǎn)生的磺酸酰胺鍵會在質(zhì)譜中發(fā)生斷裂，與酪氨酸交聯(lián)后形成的磺酸酰胺鍵卻不會斷裂。為更好地應(yīng)用該規(guī)律，該研究進一步開發(fā)了交聯(lián)鑒定軟件AixUaa。AixUaa可同時兼容并區(qū)分碎裂與不可碎裂兩種模式，實現(xiàn)了交聯(lián)肽段及位點的精確匹配，提升了交聯(lián)肽段的鑒定數(shù)量。應(yīng)用此流程，研究人員分別在大腸桿菌及哺乳動物活細胞中系統(tǒng)性地鑒定了硫氧還蛋白 1 （Trx1） 和硒蛋白 M （SELM）的直接相互作用蛋白組，驗證了該方法的有效性。

總的來說，本研究開發(fā)的基于氟磺酸基團的可富集化學交聯(lián)非天然氨基酸eFSY及交聯(lián)鑒定軟件AixUaa顯著提升了在活細胞中鑒定相互作用蛋白中化學交聯(lián)肽段的效率，克服了以往化學交聯(lián)劑在鑒定蛋白質(zhì)相互作用蛋白組的一些不足，有望應(yīng)用于更廣泛的蛋白質(zhì)相互作用研究。劉丹丹、丁文龍、程勁韜、韋秋實為本論文的共同第一作者，楊兵、唐士兵和劉超為共同通訊作者。該研究獲得了國家自然科學基金、國家重點研發(fā)計劃、浙江省自然科學基金和廣州健康院自主部署基礎(chǔ)研究項目等項目的資助。

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圖1?新型含氟磺酸基團的可富集化學交聯(lián)劑eFSY研究蛋白質(zhì)相互作用時，鑒定交聯(lián)肽段的流程圖（a），交聯(lián)肽段的碎裂規(guī)律（b）和交聯(lián)鑒定軟件AixUaa的開發(fā)流程（c）